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- In the field of reverse genetics RMCE (recombinase-mediated cassette exchange) is of increasing relevance. The procedure permits the systematic, repeated modification of higher eukaryotic genomes by targeted integration. For RMCE, this is achieved by the clean exchange of a preexisting "gene cassette" for an analogous cassette carrying the "gene of interest" (GOI). The genetic modification of mammalian cells is a standard procedure for the production of correctly modified proteins with pharmaceutical relevance. To be successful, the transfer and expression of the transgene has to be highly efficient and should have a largely predictable outcome. Actual approaches in the field of gene therapy are based on the same principles. Traditional procedures used for transfer of GOIs are not sufficiently reliable, mostly because the relevant epigenetic principles have not been sufficiently explored: transgenes integrate into chromosomes with low efficiency and at loci that provide only sub-optimal conditions for their expression. As a consequence the newly introduced information may not be realized (expressed), the gene(s) may be lost and/or re-insert and they may render the target cells in unstable state. It is exactly this point where RMCE enters the field. The procedure was introduced in 1994 and it uses the tools yeasts and bacteriophages have evolved for the efficient replication of important genetic information: Most yeast strains contain circular, plasmid-like DNAs called ´two-micron circles´. The persistence of these entities is granted by a recombinase called ´flippase´ or ´Flp´. Four monomers of this enzyme associate with two identical short (48 bp) target sites, called FRT (´flip-recombinase targets´), resulting in their crossover. The outcome of such a process depends on the relative orientation of the participating FRTs leading to the inversion of a sequence that is flanked by two identical but inversely-oriented FRT sites the deletion of a sequence that is flanked by two equally-oriented identical FRTs the inefficient addition of an extra piece of DNA carrying a single FRT site that is identical to the target site This spectrum of options could be extended significantly by the generation of FRT mutants (cross-hatched half-arrows in Figure 1). Each mutant Fn recombines with an identical mutant Fn with an efficiency equal to the wildtype sites (F x F). A cross-interaction (F x Fn) is strictly prevented by the particular design of these components. This sets the stage for the situation depicted in Figure 1A: a target cassette (here a composite +/- selection marker) is flanked by an F- and an Fn site. After its introduction into the genome of a host cell the properties of many integration sites (genomic ´addresses´) are characterized and appropriate clones are isolated the GOI (gene-of-interest) is part of a circular ´exchange plasmid´ and is flanked by a set of matching sites. This exchange plasmid can be introduced into the cell at large molecular excess and will undergo the depicted exchange (RMCE-) reaction with the pre-selected genomic address (i.e. the F <+/-> Fn target) this RMCE-principle is a process that can be repeated with the same or a different exchange plasmid. Please note that RMCE introduces just one copy of the GOI at the pre-determined locus and that it does not co-introduce prokaryotic vector sequences (dotted lines) that would otherwise trigger immunologic or epigenetic defense mechanisms. This novel procedure is not only relevant to the rational construction of biotechnologically significant cell lines, but it also finds increasing use for the systematic generation of stem cells. Stem cells can be used to replace damaged tissue or to generate transgenic animals with largely pre-determined properties.
- RMCE (engl. recombinase-mediated cassette exchange) ist ein Verfahren der reversen Genetik und dient zur systematischen Modifikation höherer Zellen durch gezielten Austausch von Genkassetten. Die Produktion pharmazeutisch bedeutender Proteine wird häufig über die genetische Modifikation von Säugerzellen erreicht. Dies bedingt Techniken des Gentransfers und die effiziente Übersetzung der genetischen Information in der Zielzelle. Auf analogen Prinzipien beruhen moderne Ansätze zur Gentherapie. Herkömmliche Verfahren der Modifikation tierischer Zellen sind wenig zuverlässig, nicht zuletzt deshalb, weil epigenetische Grundprinzipien noch zu wenig bekannt sind: eingeschleuste Gene integrieren nur sporadisch in das Erbmaterial der Wirtszelle, und wenn sie es tun, dann oft an unpassenden Stellen. Infolgedessen wird das Fremdgen nicht oder nur unregelmäßig abgelesen oder bleibt inaktiv. Zu allem Überfluss lösen sich die neu eingebauten Gene oft wieder aus dem Wirtsgenom heraus, die Zellen werden instabil. Hier setzt das RMCE-Kassettenaustauschverfahren an, das Vektoren mit Werkzeugen der Hefe versieht: In den meisten Hefestämmen gibt es ein ´2-micron circle´ genanntes Gebilde, dessen Überleben durch eine Rekombinase (genannt "Flp") mit ungewöhnlichen Eigenschaften garantiert wird. Vier Monomere Moleküle dieses Enzyms binden an zwei identische, kurze Erkennungsstellen (Flp-recombinase targets, FRT; rote Halbpfeile in der Abbildung) und führen zu deren Rekombination. Das Resultat dieses Vorganges ist (je nach der relativen Orientierung der FRT-Stellen) eine Inversion (Umdrehen der von zwei entgegengesetzt orientierten FRT-Stellen eingerahmten Sequenz), eine Deletion (Verlust einer von zwei gleichgerichteten FRTs eingerahmten Sequenz) oder, in Umkehr dieses Vorganges, eine ineffiziente Addition (Vereinigung zweier DNA-Segmente, die gleichartige FRT-Stellen tragen). 1994 konnte das Spektrum dieser Möglichkeiten erweitert werden. Hierfür wurden Mutanten (Fn; schraffierte Halbpfeile in der Abbildung) dieser FRT-Stellen (F) hergestellt, die untereinander so effizient wie zwei Wildtyp-Stellen rekombinieren. Eines zeigen sie nicht: eine Kreuzrekombination der Art F x Fn, die zur Deletion führen würde. Damit befinden wir uns in der Situation der Abbildung: * ein beliebiges Gen (hier ein zusammengesetztes Selektionsgen) wird durch einen Satz aus FRT-Stellen, Fn und F, eingefasst; nach seiner Einführung in das Genom der Wirtszelle werden die Eigenschaften verschiedener Integrationsstellen charakterisiert und besonders geeignete Klone isoliert; * das eigentlich interessierende Gen wird zwischen einen entsprechenden Satz an Fn und F Stellen (je ein roter und ein schraffierter Halbpfeil) kloniert und als Teil eines zirkulären Vektors in die Wirtszelle transferiert. Flp Rekombinase wird nun genutzt, um einen doppelt-reziproken ´crossover´ zu induzieren. Dies Verfahren dirigiert nach dem "RMCE- Kassettenaustausch-Prinzip" das interessierende Gen exakt an den vorbestimmten Ort - ein Prozess, der sich beliebig oft mit unterschiedlichen Konstrukten wiederholen lässt. Dieses neue Verfahren gelangt nicht nur für die rationale Konstruktion biotechnologisch bedeutender Zelllinien Bedeutung, sondern wird auch zunehmend für die systematische Modifikation von Stammzellen eingesetzt, z.B. mit der Absicht, gezielt transgene Tiere zu schaffen.
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